[摘要] 目的 利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因(mdrl)，逆转肿瘤抗药性。方法 按照锤头结构模型设计、合成了核酶196mdrl(196 rz)，并定向克隆人包含rna多聚酶ⅲ启动子的逆转录病毒载体中。通过脂质体介导，将抗mdrl核酶表达质粒(n2a+trnamet-imdrl-rz)导入人肝癌耐药细胞株hepg2。分别采用rt-pcr、荧光pcr、蛋白质印迹分析(western blot)、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及mtt方法，观察细胞的rz、mdrl mrna、p糖蛋白(pgp)表达和对化疗药物敏感性的变化。结果 经抗mdrl核酶处理的耐药hepg2细胞，rz稳定表达，mdrl mrna、pgp明显降低，细胞内罗丹明聚集，对阿霉素的敏感性提高200倍。结论 针对多药耐药基因mdrl的核酶可明显降解mdrl mrna，抑制pgp的表达，具有强大的逆转肝癌耐药细胞hepg2多药耐药的作用。

[关键词] 肝肿瘤；p-糖蛋白；多药耐药性

肝癌的多药耐药性(multidrug resistance，mdr)严重影响着肝癌的化疗效果和预后。而传统的mdr逆转剂是作用在p糖蛋白(pglycoprotein，pgp)水平，效率低，副作用大。核酶(ribozyme，rz)是可作用于靶mrna的具有催化活性的rna，ayre等[1]提出了锤头结构模型并利用锤头状核酶在体外或细胞内特异性切割mrna，阻断基因的表达。随着分子生物学发展，尤其是对核酶的研究为肝癌mdr的逆转提供了新的策略。核酶通过碱基配对，特异地与靶mrna结合，并切割分解靶mrna。其突出的高效率、高特异性、少副作用，被誉为分子剪刀，为从基因水平逆转mdr展示了良好的前景。本研究旨在探讨用这一先进技术来逆转mdr的可能性。

材料与方法

1．细胞模型的建立：人肝癌耐药细胞系hepc2，由华中科技大学同济医学院肝脏外科中心实验室建株。在37℃、5％co2条件下，以含10％小牛血清、青霉素(100 u／ml)、链霉素(100 μg/ml)的rpmi1640培养液中进行细胞培养和传代。

2．核酶的构建和克隆人载体：核酶质粒由日本hiroyuki kobayashi博士惠赠。用限制性内切酶bamhi and stui，将包含△3′-5′mutant humantrnaimet，基因的500 bp的dna片段从phh2d△3′-5′质粒中抽提出来，并将之克隆人含3′长末端重复的n2a载体上的snabi位点。设计为n2a+trnaimet构建质粒n2a+trnaimet-imdrl-rz，通过转染大肠杆菌dh5α纯化抽提质粒(promaga，质粒抽提试剂盒)，转染gp+envaml2细胞用以病毒包装。

3．hepg2细胞的转染和筛选：取6孔培养板，每孔接种约8×104**hepg2细胞，细胞生长汇合达70％时开始转染。质粒dna20μg，脂质体10μl，孵育时间6 h。分别设置转染组(a组)和未转染组(b组)。待转染细胞生长72 h后，细胞接近融合时，按1：3密度传代；继续培养至细胞密度达80％融合时，加浓度为80μg/ml的g418培养液进行筛选，以未转染的细胞做筛选对照。当对照细胞绝大部分死亡时，再更换一次转染细胞的筛选培养液(浓度为800 μg/ml)，2d后，将g418浓度降至400μg/ml维持筛选；3周后可见抗性克隆形成，消化收集克隆后继续培养待测各种指标。

4．rt-pcr检测mdrl mrna表达：采用trizol试剂提取细胞总rna，-70℃保存备用。除特别标明的试剂外，均使用promega公司的rt／pcr试剂盒。以mj公司ptcl00型pcr仪作热循环：预变性94℃2 min；循环：94℃30s、57℃ 45s、72℃ 60s，共35个循环。循环后延伸72℃ 5 min。pcr后，以2％琼脂凝胶电泳检测扩增结果；gds8000型凝胶成像分析系统对目的dna条带扫描，确定其光密度值，将mdrl与β-actin比值作为mdrl表达水平的参数，对mdrl产物相对定量。mdrl与β-actin的引物设计参照基因库，运用引物设计软件自行设计。

5．定量rt-pcr：(1)仪器：美国abi prism7700扩增仪；上海久盛公司提供abi prism 7700微量荧光检测仪及数据处理软件。(2)试剂：由上海久盛公司提供dna荧光定量试剂盒。(3)方法：遵照仪器及试剂盒使用说明进行样本检测。引物及探针设计根据基因库，运用引物设计软件自行设计。斑点杂交法报告阴、阳性结果；fg pcr以n+4／5(p1n)为判断标准(n为空白对照之荧光强度，pl为102copy／ml阳性质控品之荧光强度)，样品荧光强度小于该标准为阴性，大于该标准为阳性，并通过曲线获得dna含量。

6．蛋白质印迹分析：收集细胞以冷pbs清洗2次，以裂解缓冲液[50 mmol／l tris cl(ph=8.0)，120 mmol／l nacl，0.2 mmol／l edta，1 mmol／lpmsf和1％np40]提取总蛋白，取150μg总蛋白上样进行sds page电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上，氨基黑染色30s，10％乙酸脱色。加入封闭缓冲液室温振荡1 h，将膜放入溶有鼠抗人pgp、mrp、lrp蛋白单克隆抗体(1：1000稀释)的新鲜配制封闭液4℃下振荡2h，漂洗后滴加羊抗鼠igg，ecl曝光显色。

7．细胞对r123的蓄积作用和外排测定：l×109／l单细胞悬液，加入2.5 mg/l的荧光染料r123，37℃ co2培养箱中培养45 min后，用pbs漂洗2次(1500r/min，3min)，取250μl用作r123蓄积测定，试管内余液加培养液，37℃培养45 min，取250μl作外排测定，在λex=488 nm、λem=525 nm处测定r123荧光强度，每个样品测定约104个细胞。

8．细胞药敏试验(mtt试验)：将细胞数调整至3×104／ml，取96孔板，每孔加入200μl细胞悬液，培养箱中过夜；去掉培养液，加入用1640配制的不同浓度的阿霉素溶液(每m;分别含0.00001μg，0.0001 μg，0.001 μg，0.0l μg，0.1 μg，l μg，10 μg，100μg)，200μl／孔，细胞培养箱中48 h后，每孔加入mtl20 μl(10mg/ml)，保温4h。弃上清，加入二甲亚砜200 μl／孔，酶标仪上测出550 nm值，算出id50并做图。

9．激光共聚焦检测核酶转染细胞的凋亡：收集细胞，pbs漂洗2-3次，生理盐水调整细胞密度为l×lo／ml的细胞悬液，将细胞涂于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，吹干，用新配制的40g/l多聚甲醛室温下固定30 min，宝灵曼公司生产的细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测，bio-radmrc-1024激光共聚焦显微镜观察，每张玻片选取3个视野进行荧光强度的定量分析，结果以灰度值表示。

10．统计学方法：实验结果采用方差分析和相关分析。

结果

1．耐药hepg2细胞系和hepg2-imdrl-srz细胞系的mdr特性：两细胞系经20h倍增后，姬姆萨染色，显微镜下观察，与母系hepg2细胞相比未发现有形态学的改变。rt-pcr检测hepg2-imdr1-srz细胞系，能稳定表达rz，扩增片段120bp。耐药hepg2细胞mdrl／pgp大量表达；hepg2-imdrl-sr2细胞系mdrl／pgp表达则明显减少。

2．药敏试验：hepg2-imdr1-s rz细胞系对长春新碱、阿霉素的药物敏感性完全恢复。核酶能完全逆转肝癌耐药细胞的耐药性。

3. pgp功能测试(罗丹明试验)：罗丹明流式细胞术结果提示，hepg2-imdr1-s rz细胞系细胞荧光强度显著高于耐药hepg2细胞系细胞。罗丹明是pgp的特异性荧光底物，能被pgp从细胞内泵出，hepg2-imdrl-s rz细胞由于pgp的含量减少，排出罗丹明的功能下降，细胞内罗丹明聚积，故荧光强度明显高于耐药hepg2细胞系细胞。

4．激光共聚焦检测细胞凋亡：阿霉素诱导的hepg2细胞，转染imdrl-sr2后，出现染色体边集，核碎裂，出现凋亡小体。

mdr的发生机制较多，目前认为pgp是形成mdr的最主要机制[2,3]。因此，有关mdr的逆转录研究也主要集中于对这一机制上。研究者们曾试图用药物来逆转mdr，非细胞抑制剂量的异博定(verapemil，vpl)能明显降低肿瘤细胞对长春新碱(vincristine，vcr)的耐药性[4,5]。尽管很多药物都有不同程度的逆转mdr作用，但是这些药物均只是在较高浓度条件下才能发挥作用，由于毒副作用，临床上不可能达到如此高的血药浓度，使应用药物逆转mdr受到限制。

近年来，锤头状核酶用于基因治疗已取得很大进展，特别是在成功抑制hiv-1、bcl-abl、c-erbb-2、c-ras-1、p23h表达研究中的成果更是让人们对基因治疗的前景充满信心。核酶用于mdr的逆转研究近年来才有报道，kobayashi等[6,7]合成两个核酶基因，分别切割mdrl mrnal96位和179位密码子，将切割mdrl mrnal96位密码子的核酶构建于phβaprlneo载体上，电穿孔法导人到耐药的人急性淋巴母细胞白血病细胞系molt3／tmq800中，转染核酶后molt3／tmq800对vcr的耐药性由原来的700倍(与其母细胞molt3比较)下降至20-30倍。在耐药的胰腺癌细胞系应用核酶逆转mdr，耐药性更是由原来的1600倍下降至5.3倍。研究显示，核酶逆转mdr的效率其催化切割位点最为重要，另外，载体途径和核酶与细胞浓度比也非常关键。有效的载体途径可以将核酶转入耐药细胞，高浓度的核酶可以在细胞内达到有效浓度，从而使逆转效果更加彻底。

我们使用n2a病毒载体包装trnaimet-imdrl-rz，构建质粒n2a+trnaimet-imdrl-rz，纯化扩增后转入耐药hepg2细胞系，该196切割位点的核酶能完全恢复化疗敏感性。rt-pcr结果显示：rz稳定表达于耐药hepg2细胞，real-time rt-pcr和western blot显示转染后的耐药细胞mdrl／pgp表达较耐药hepg2细胞明显减少，rhodamine试验也显示rz转染后的hepg2细胞pgp的量和功能均明显降低。mtf试验除了恢复阿霉素的敏感性，同时可以恢复长春新碱等化疗药的敏感性。

显微镜下观察发现，与母系hepg2细胞相比，耐药hepg2细胞的生物学特性没有发生明显改变，其细胞数量和倍增时间未见明显变化。同样，核酶转染后的耐药hepg2细胞其生物学特性也未发现有明显改变。但有趣的是，在转染后的耐药细胞，激光共聚焦却发现许多细胞凋亡增加，其具体的机制有待于进一步研究。

另外，核酶逆转hepg2细胞后，尽管可以完全恢复化疗的敏感性，但核酶并没有完全抑制mdrl／pgp的表达，考虑转入核酶与mdrl mrna比例不平衡及细胞内mdrl mrna二、三级结构的变化影响核酶与靶rna的结合，导致核酶活性下降。也可能与其他未知因素有关。

总之，利用特异性切割位点的核酶抑制肿瘤细胞mdrl／pgp的表达逆转mdr，为进一步深入进行动物体内实验逆转mdr和临床mdr逆转提供了有价值的探索。